金属表面DNA提取检测方法
本实验通过比较4种常规提取方法对金属表面DNA提取效果进行观察，并改进常规提取过程中试剂配比及操作流程，初步建立了留存在金属表面DNA的提取方法。
1材料及方法
1.1材料
2008年至2010年发生的刑事案件中收集到沾染有血迹的金属物品（兰州市公安局DNA实验室提供）30件，其中生铁制品22件(生铁制品表面均已生成镑斑)，不锈钢制品8件。用棉签滴蘸去离子水转移金属表面斑迹并进行抗人血红蛋白检测，结果均为阳性。
9700型PCR扩增仪（AB)、7500荧光定量PCR(AB)、3130XL遗传分析仪。
1.2提取方法
1.2.1chelex-100I提取法剪取棉签（面积约
为0.2cmX0.2cm)放人1.5mLEppendorf管中，加人
1.OmL去离子水室温浸泡30min，12000r/min离心，去上清，l.OmL去离子水洗涤3遍，加人0.lmL5%Chelex-100溶液（同时做10%浓度比较试验）和8；xL1%蛋白酶K，56°C水浴lh，震荡10s，98。。水浴8min〜lOmin,12000r/min离心3min，备用。
1. 2.2纯化柱纯化柱提取参照QIAampDNABloodKits纯化试剂盒使用说明书。
1.2.3磁洙法磁珠法提取参照IQ™磁珠提取试剂盒使用说明书。
1.2.4chelex-100II提取法剪取棉签（面积约为
0. 2cmX0.2cm)放人1.5mLEppendorf管中，加人
1. OmL去离子，室温浸泡30min，每lOmin震荡10s，12000r/min离心，去上清，1.OmL去离子水洗潘2遍，加人50mL10%Chelex-100溶液、8士1%蛋白酶K、l^LcRNA，56°C水浴lh(水浴30min加入30juLSDS)，每20min加人20士5%Chelex-100溶液震荡，加人SOjtxLTween-20(0.05%),56'C水浴30min，震荡，98°C水浴8min〜10min，13000r/min离心3min,备用。
1.3 扩增
检材定量结果DNA浓度髙于0.02ng/(uL样本按比例用去离子水稀释至0.02ng/fxL,DNA浓度低于
0. 02ng/^L的样本按原有浓度进行STR检测。应用ABI公司的AmpFISTRIdentifiler™试剂盒进行复合扩增，PCR碰在ABI-97CX)金座扩增仪上进行28个循环扩增。
1.4 检測
1.4.1荧光定量绝对定量实验参照ABI7500实时定量PCR仪操作指南，具体数据见表1。
1. 4.2STR检測STR检测参照ABI3130XL基因分析仪操作指南，收集结果用GenemapperIDv3.2软件进行基因型分析。
表130例样本检测及四色荧光分析结果
样本 提取方法 DNA浓度范围（ng) DNA平均浓度（ng) 检出率％(9〜15个基因座） 检出率％(16个基因座） 峰值效果
锈斑血迹（22) chelex-100法5% 0.0141-0.065 0.0397士0.008 95.5 4.5 峰值较低，均一性差，大片段缺失严重
 chelex-100法10% 0.019-0.094 0.047±0.011 86.5 13.5 峰值较低，均一性强
 纯化柱 0.023-0.225 0.088±0.013 77.5 22.5 无杂峰，均一性强
 磁珠法 0.0087一0.015 0.01士0.005 41.0 0.〇 位点缺失严重
不锈钢血迹(8) chelex-100U 0.086—0.203 0.055士0.017 22.7 77.3 峰值均一性好
 chelex-100法5% 0.135-0.288 0.245±0.09 22.7 77.3 峰值均一性差，大片段部分缺失
 chelex-100法10% 0.102—0.276 0.201±0.019 27.2 72.8 峰值均一性差，大片段部分缺失
 纯化柱 0.141—0.255 0.234士0.013 0.0 100 无杂峰，峰值均一性强
 磁珠法 0.11-0.188 0.132±〇.056 77.5 22.5 峰值均一性差，大片段峰值较低
 chelex-100II 0.12-0.254 0.201±0.032 27.2 72.8 峰值均一性好
2结果与讨论
以2008Y169案件为例，现场物证提取一木把菜刀，菜刀表面有锈红色痕迹，抗人Hb试纸检验为阳性，表明有人血残留。经chelex-100I提取法、chel-ex-100H提取法、纯化、磁珠法等4种方法提取DNA并检测，结果如图1。
DNA检材绝对浓度明显小于其他几种方法；（2)纯化柱能有效地减少干扰PCR扩增的抑制因素，从而高效回收、纯化模板DNA，但是使用成本较高；（3)chelex-100H提取法于其他几种方法相比，在降低使用成本的同时有效地提高了模板DNA的回收效率。
Chelex-100是一种螯合型的离子交换树脂，由交联聚苯乙稀凝胶和亚胺基乙烯乙酸等组成，后者作为螯合基团可与金属离子结合，阻止金属离子在高温和低离子强度下作为催化剂降价DNA[3]，且不影响需Mg2+的PCR反应。本文在实际案件操作中适当加大Chelex-100的浓度，结果表明能有效地提高本文所涉及检材模板DNA的回收率(锈斑血迹5%chel-ex-100I提取法检出16个基因座，检出率为4.5%;10%chekx-100D：提取法检出16个基因座，检出率为13.5%)。
(感谢兰州市公安局刑警支队刑事科学技术研究所DNA实验室全体警务人员对本文的支持）
参考文献：
[1]裴黎，牛慧媛，涂政，等.两种DNA提取方法检测微量陈旧汗斑1例[J].刑事技术，2006(6):43-45.
[2]董林芳，裴黎，涂政，等.联合应用chelexlOO和磁珠法检测霉变皮上衣微量DNA1例[J].刑事技术，2008(6)：68-69.
[3]郑秀芬.法医DNA分析[M].北京：中国人民公安大学出版社，2002:410，435,425.